Odgovor:
Mnogi…
Obrazloženje:
Postoje mnogi razlozi zašto se bendovi možda neće pojaviti na zapadnoj podlozi. Jesu li kombinacije uzoraka i antitijela radile u prošlosti?
U nastavku su samo neki od kojih se mogu sjetiti u ovom trenutku koji mogu uzrokovati da se bendovi ne pojavljuju:
-
Je li prijenos proteina iz gela? Pokušajte obojiti membranu s nečim poput ponceau S ili amido crne da vidite jesu li prisutne trake. Ponekad možete vidjeti proteinske vrpce na membrani tako da ih navlažite i držite pod kutom prema svjetlu.
-
Djeluje li primarno antitijelo? Ovo je teško testirati i jedini način na koji to možete je uključivanje pozitivne kontrole tamo gdje znate da je prisutan protein od interesa. Ako imate neki od proteina od interesa, mogli biste ga pokušati uočiti na Western blotting membrani (tj. Ne pokrećete gel) i vidjeti ako dobijete rezultat ako obrađujete membranu kao da je Western blot.
-
Je li sekundarno antitijelo prepoznaje primarno antitijelo? Opet, teško je testirati. O jedinom testu koji možete napraviti je gore spomenuti test u 2..
-
Radi li sustav za detekciju? Ovisno o metodi detekcije koju upotrebljavate, možete pokušati napuniti neke od sekundarnih antitijela da biste vidjeli radi li otopina za detekciju, kao i aktivirajuće sredstvo / enzim na sekundarnom antitijelu. To jest, možete li pokrenuti reakciju samo sa sekundarnim antitijelima?
Naposljetku, to bi moglo biti jednostavno kao jedno od rješenja korištenih tijekom sondiranja nepravilno sastavljene parcele. Na primjer, ako je koncentracija soli u puferu pogrešna, to može uzrokovati oslobađanje antitijela iz blota. Isto bi se dogodilo i ako bi pH pufera bio netočan.
"Najčudniji" uzrok zapadnjačkog upijanja koje nisam osobno iskusio bio je kada smo promijenili dobavljača mlijeka u prahu kojim smo blokirali membranu. Prašak iz novog dobavljača sadržavao je fosfotirozin fosfatazu koja je uklonila sve fosfatne skupine koje smo pokušavali otkriti našim anti-fosfotirozinskim antitijelima.
Točan odgovor je a = 9/2, ali kako bi mogao biti dio ako Georgeu mogu biti dodijeljene samo točke kao cijeli brojevi?
Zato što je "očekivana vrijednost" prosjek, a ne broj. Pogledajmo sve mogućnosti s H glavama, a T repom. {:( "Penny", "Dime", "Nickel"), (H, H, H), (H, H, T), (H, T, H), (H, T, T), (T , H, H), (T, H, T), (T, T, H), (T, T, T): Ova tablica iscrpljuje svaku moguću mogućnost, od bacanja tri glave do bacanja tri repa. Sada dodajte točke, 3 boda za svaki primjer bacanja glava. {:( "Penny", "Dime", "Nickel" "mjestima"), (H, H, H, 9), (H, H, T, 6), (H, T, H, 6), (H, T, T, 3), (T, H, H, 6), (T, H, T, 3), (T, T, H, 3), (T, T, T, 0): } Očekivana vrijednos
Zašto se GAPDH koristi u Western Blotu? + Primjer
GAPDH se često koristi kao kontrola punjenja. U Western blotingu često koristimo GAPDH kao kontrolu punjenja. To znači da sondiranjem GAPDH-a možemo provjeriti imamo li napunjene ekvivalentne količine proteina na različitim stazama blota. Primjer uporabe - kažemo da imamo bolest za koju mislimo da uzrokuje povišenje određenog proteina u stanici. Napravili bismo uzorak od "zdravih" stanica i drugog uzorka iz "oboljelih" stanica. Tada bismo na gelu za Western blot učitali ekvivalentne količine proteina oba uzorka. Nakon što smo probali blot za naš interesni protein, otkrili smo da je u bolesnim stanicama
Zašto bi se mjehurići trebali izbjegavati u Western blotu?
Kako bi se omogućio pravilan prijenos proteina na Western blot membranu nakon završetka SDS-PAGE, gel se uklanja iz lijevanog sloja, a zatim se napravi Western blot, kao što je prikazano na slici, nakon što je podešavanje završeno, električni naboj se primjenjuje s proteinskim gelom na negativnoj strani i membrani na pozitivnoj strani. kada je ova postavka potpuna, proteini se prenose na membranu zbog primijenjenog električnog polja. budući da se primjenjuje konstantno električno polje, ako mjehurići puzu između gela i membrane, tada se protein ne može prenijeti na membranu zbog sljedećeg razloga postoji razmak između memb