Zašto se Western blot koristi za potvrdu elise? + Primjer

Odgovor:

Obično je to test specifičnosti antitijela.

Obrazloženje:

U ELISA-i je vrlo teško odrediti da li se vaše antitijelo veže za vaš interesni protein, potpuno različit protein ili niz proteina.

Western blot će se koristiti za provjeru specifičnosti antitijela (treba imati na umu da Western blot ne može otkriti sve unakrsne reakcije s netočnim proteinima).

U Western blot-u možete vidjeti veličinu proteina na koji je antitijelo vezano (ne možete u ELISA-i). Stoga, na primjer, ako vaše antitijelo treba biti vezano za protein od 56 kDa i vidite traku na ~ 56 kDa na blotu, tada možete biti razumno sigurni da se antitijelo veže na ispravan protein.

Ako ste, s druge strane, vidjeli pojas na 32 kDa, mogli biste zaključiti da se antitijelo veže na pogrešan protein. Isto tako, ako se na zapadnom blotu pojavi mnogo traka koje bi ukazivale (u odsutnosti degradacije proteina) da se antitijelo veže za niz različitih proteina.

U primjeru 32 kDa trake koja se pojavljuje na gelu, kao i na višestrukim trakama, to bi značilo da antitijelo nema specifičnost za ELISA i da bilo koji rezultati koji se vide u ELISA-i ne mogu biti specifični za protein od interesa.

Ako bih ja vodio ovu vrstu testa, mogao bih uključiti neku vrstu "ometajućeg" reagensa za testiranje antitijela. Na primjer, ako sam podigao svoje antitijelo na peptid I može uključiti peptid u primarnoj otopini antitijela da bi se testirala ispravnost vezanja. To jest, u prisutnosti peptida ne bi trebalo vidjeti traku ili rezultat ELISA testa jer moje primarno antitijelo ne bi moglo biti vezano zbog prisutnosti viška peptida.